O ṣeun fun lilo si Nature.com. Ẹya ẹrọ aṣawakiri ti o nlo ni atilẹyin CSS lopin. Fun iriri ti o dara julọ, a ṣeduro pe ki o lo ẹrọ aṣawakiri imudojuiwọn kan (tabi mu Ipo Ibamu ṣiṣẹ ni Internet Explorer). Lakoko, lati rii daju pe atilẹyin tẹsiwaju, a yoo ṣe aaye naa laisi awọn aza ati JavaScript.
Thermophiles jẹ microorganisms ti o ṣe rere ni awọn iwọn otutu giga. Kikọ wọn le pese alaye ti o niyelori nipa bi igbesi aye ṣe ṣe deede si awọn ipo ti o buruju. Sibẹsibẹ, o ṣoro lati ṣaṣeyọri awọn ipo iwọn otutu giga pẹlu awọn microscopes opiti deede. Orisirisi awọn ojutu ti a ṣe ni ile ti o da lori alapapo itanna elekitiriki ti agbegbe ni a ti dabaa, ṣugbọn ko si ojutu iṣowo ti o rọrun. Ninu iwe yii, a ṣafihan imọran ti alapapo laser microscale lori aaye wiwo maikirosikopu lati pese awọn iwọn otutu giga fun awọn iwadii thermophile lakoko ti o jẹ ki agbegbe olumulo jẹ ìwọnba. Alapapo Microscale ni iwọn ina lesa iwọntunwọnsi le ṣee ṣe ni lilo sobusitireti nanoparticle goolu ti a bo bi ibaramu ati imudani ina to munadoko. Awọn ipa to ṣeeṣe ti convection ito microscale, idaduro sẹẹli, ati išipopada thermophoretic centrifugal ni a jiroro. Ọna naa ti ṣe afihan ni awọn ẹya meji: (i) Geobacillus stearothermophilus, kokoro-arun thermophilic ti nṣiṣe lọwọ ti o tun ṣe ni iwọn 65 ° C, eyiti a ti ṣe akiyesi lati dagba, dagba ati we labẹ alapapo microscale; (ii) Thiobacillus sp., hyperthermophilic archaea ti o dara julọ. ni 80°C. Iṣẹ yii ṣe ọna fun akiyesi irọrun ati ailewu ti awọn microorganisms thermophilic nipa lilo awọn irinṣẹ airi airi ode oni ati ifarada.
Lori awọn ọkẹ àìmọye ọdun, igbesi aye lori Earth ti wa lati ni ibamu si ọpọlọpọ awọn ipo ayika ti o jẹ igba miiran ti o pọju lati irisi eniyan wa. Ni pato, diẹ ninu awọn microorganisms thermophilic (kokoro, archaea, elu) ti a npe ni awọn thermophiles ṣe rere ni iwọn otutu lati 45 ° C si 122 ° C1, 2, 3, 4. Thermophiles n gbe ni orisirisi awọn ilolupo eda abemi, gẹgẹbi awọn vents hydrothermal omi jinlẹ, awọn orisun omi gbona. tabi awọn agbegbe folkano. Iwadi wọn ti ṣe agbejade iwulo pupọ ni awọn ọdun diẹ sẹhin fun o kere ju awọn idi meji. Ni akọkọ, a le kọ ẹkọ lati ọdọ wọn, fun apẹẹrẹ, bawo ni awọn thermophiles 5, 6, awọn enzymu 7, 8 ati awọn membran 9 jẹ iduroṣinṣin ni iru awọn iwọn otutu ti o ga, tabi bii awọn thermophiles ṣe le koju awọn ipele to gaju ti radiation10. Keji, wọn jẹ ipilẹ fun ọpọlọpọ awọn ohun elo imọ-ẹrọ imọ-ẹrọ pataki1,11,12 gẹgẹbi iṣelọpọ epo13,14,15,16, iṣelọpọ kemikali (dihydro, alcohols, methane, amino acids, bbl)17, biomining18 ati thermostable biocatalysts7,11, 13. Ni pataki, iṣesi ẹwọn polymerase ti a mọ daradara (PCR) 19 kan pẹlu henensiamu kan (Taq polymerase) ti o ya sọtọ lati inu kokoro-arun thermophilic Thermus aquaticus, ọkan ninu awọn thermophiles akọkọ lati ṣe awari.
Sibẹsibẹ, iwadi ti awọn thermophiles kii ṣe iṣẹ ti o rọrun ati pe a ko le ṣe imudara ni eyikeyi yàrá ti ibi. Ni pataki, awọn thermophiles alãye ko le ṣe akiyesi ni fitiro pẹlu maikirosikopu ina boṣewa eyikeyi, paapaa pẹlu awọn iyẹwu alapapo ti o wa ni iṣowo, nigbagbogbo ni iwọn fun awọn iwọn otutu bi 40°C. Lati awọn ọdun 1990, awọn ẹgbẹ iwadii diẹ nikan ti ya ara wọn si ifihan ti awọn ọna ṣiṣe microscopy giga-giga (HTM). Ni ọdun 1994 Glukh et al. Iyẹwu alapapo / itutu agbaiye ti loyun ti o da lori lilo sẹẹli Peltier kan ti o ṣakoso iwọn otutu ti awọn capillaries onigun ni pipade lati ṣetọju anaerobicity 20. Ẹrọ naa le jẹ kikan si 100 °C ni iwọn 2 °C / s, gbigba awọn onkọwe laaye lati ṣe iwadi awọn motility ti hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima21. Ni ọdun 1999 Horn et al. Ẹrọ ti o jọra pupọ ti ni idagbasoke, ti o tun da lori lilo awọn capillaries ti o gbona ti o dara fun microscopy ti iṣowo lati ṣe iwadi pipin / isopọ sẹẹli. Lẹhin igba pipẹ ti aiṣiṣẹ ibatan ibatan, wiwa fun awọn HTM ti o munadoko bẹrẹ ni ọdun 2012, ni pataki ni asopọ pẹlu lẹsẹsẹ awọn iwe nipasẹ ẹgbẹ Wirth ti o lo ẹrọ ti a ṣe nipasẹ Horn et al. Ni ọdun mẹdogun sẹhin, motility ti nọmba nla ti archaea, pẹlu hyperthermophiles, ni a ṣe iwadi ni awọn iwọn otutu to 100 ° C nipa lilo awọn capillaries ti o gbona23,24. Wọn tun ṣe atunṣe maikirosikopu atilẹba lati ṣaṣeyọri alapapo yiyara (awọn iṣẹju pupọ dipo iṣẹju 35 lati de iwọn otutu ti a ṣeto) ati ṣaṣeyọri iwọn otutu laini ti diẹ sii ju 2 cm kọja alabọde naa. Ẹrọ apẹrẹ iwọn otutu yii (TGFD) ni a ti lo lati ṣe iwadi iṣipopada ti ọpọlọpọ awọn thermophiles laarin awọn iwọn otutu iwọn otutu ni awọn ijinna ti o ni ibatan ti isedale 24, 25.
Alapapo awọn capillaries pipade kii ṣe ọna nikan lati ṣe akiyesi awọn thermophiles laaye. Ni ọdun 2012, Kuwabara et al. Awọn iyẹwu Pyrex isọnu ti a ṣe ni ile ti a fi edidi pẹlu alemora ti ko gbona (Super X2; Cemedine, Japan) ni a lo. Awọn ayẹwo naa ni a gbe sori awo alapapo sihin ti iṣowo ti o wa (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japan) ti o lagbara lati ṣe alapapo si 110 ° C, ṣugbọn kii ṣe ipinnu akọkọ fun bioimaging. Awọn onkọwe ṣe akiyesi pipin daradara ti awọn kokoro arun anaerobic thermophilic (Thermosipho globiformans, akoko ilọpo meji 24 min) ni 65°C. Ni ọdun 2020, Pulshen et al. Alapapo daradara ti awọn ounjẹ irin ti iṣowo (Attofluor TM, Thermofisher) ti ṣe afihan nipa lilo awọn eroja alapapo ile meji: ideri ati ipele kan (iṣeto atunto ẹrọ PCR). Ẹgbẹ yii ṣe abajade ni iwọn otutu omi iṣọkan kan ati ṣe idiwọ evaporation ati condensation ni isalẹ ideri. Lilo ohun O-oruka yago fun paṣipaarọ gaasi pẹlu ayika. HTM yii, ti a pe ni Sulfoscope, ni a lo lati ṣe aworan Sulfolobus acidocaldarius ni 75°C27.
Idiwọn ti a mọ ti gbogbo awọn ọna ṣiṣe wọnyi ni ihamọ si lilo awọn ibi-afẹde, eyikeyi immersion epo ko yẹ fun iru iwọn otutu ti o ga ati fun aworan nipasẹ> 1-mm awọn apẹẹrẹ ti o nipọn ti o nipọn. Idiwọn ti a mọ ti gbogbo awọn ọna ṣiṣe wọnyi ni ihamọ si lilo awọn ibi-afẹde, eyikeyi immersion epo ko yẹ fun iru iwọn otutu ti o ga ati fun aworan nipasẹ> 1-mm awọn apẹẹrẹ ti o nipọn ti o nipọn. Общепризнаныm ностатком всех систем было ограничение на использование воздушныh объективов е погружение в масло не подходило для такой высокой температуры Aipe ti a mọ ti gbogbo awọn ọna ṣiṣe wọnyi ni aropin si lilo awọn ibi-afẹde, nitori eyikeyi immersion epo ko dara fun iru iwọn otutu giga ati fun iwoye nipasẹ awọn apẹẹrẹ sihin> 1 mm nipọn.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不认限制是限使厚的透明样品成像。 Idiwọn ti a mọ ti gbogbo awọn ọna ṣiṣe wọnyi jẹ aropin ti lilo digi ti o ni afẹfẹ, bi eyikeyi immersion epo ko yẹ fun awọn apẹẹrẹ ti o han gbangba aworan> 1 mm nipọn ni iru awọn iwọn otutu giga. Общепризнанныm ностатком всех систем являеся ограниченое ужение в масло непригодно для таких высоких температур и визуализации через прозрачные образцын Idaduro ti a mọ ti gbogbo awọn ọna ṣiṣe wọnyi ni opin lilo ti awọn lẹnsi afẹfẹ, eyikeyi immersion epo ko yẹ fun iru awọn iwọn otutu giga ati iwoye nipasẹ awọn apẹẹrẹ sihin> 1 mm nipọn.Laipẹ diẹ, aropin yii ti gbe soke nipasẹ Charles-Orzag et al. 28, ti o ni idagbasoke a ẹrọ ti ko si ohun to pese ooru ni ayika awọn eto ti awọn anfani, sugbon dipo inu awọn ideri gilasi ara, bo pelu kan tinrin sihin Layer ti a resistor ṣe ti ITO (indium-tin oxide). Ideri le jẹ kikan si 75 °C nipa gbigbe lọwọlọwọ ina nipasẹ Layer ti o han. Sibẹsibẹ, onkọwe gbọdọ tun gbona lẹnsi si ibi-afẹde, ṣugbọn kii ṣe ju 65 ° C, nitorinaa ki o ma ba bajẹ.
Awọn iṣẹ wọnyi fihan pe idagbasoke ti maikirosikopu opiti iwọn otutu ti o munadoko ko ti gba lọpọlọpọ, nigbagbogbo nilo ohun elo ti ile, ati pe nigbagbogbo ni a ṣe aṣeyọri ni idiyele ti ipinnu aye, eyiti o jẹ aila-nfani nla nitori pe awọn microorganisms thermophilic ko tobi ju diẹ lọ. micrometers. Iwọn alapapo ti o dinku jẹ bọtini lati yanju awọn iṣoro atorunwa mẹta ti HTM: ipinnu aye ti ko dara, inertia gbigbona giga nigbati eto ba gbona, ati alapapo ipalara ti awọn eroja agbegbe (epo immersion, lẹnsi idi… tabi ọwọ olumulo) ni awọn iwọn otutu to gaju. ).
Ninu iwe yii, a ṣafihan HTM kan fun akiyesi thermophile ti ko da lori alapapo resistive. Dipo, a ṣaṣeyọri alapapo agbegbe laarin agbegbe to lopin ti aaye wiwo maikirosikopu nipasẹ itanna lesa ti sobusitireti gbigba ina. Pipin iwọn otutu jẹ ojuran nipa lilo maikirosikopu alakoso pipo (QPM). Imudara ọna yii jẹ afihan nipasẹ Geobacillus stearothermophilus, kokoro-arun thermophilic motile ti o tun ṣe ni iwọn 65 ° C ati pe o ni akoko ilọpo meji kukuru (nipa iṣẹju 20), ati Sulfolobus shibatae, hyperthermophile ti o dagba ni aipe ni 80 ° C (archaea) lati ṣapejuwe. Iwọn isọdọtun deede ati odo ni a ṣe akiyesi bi iṣẹ ti iwọn otutu. HTM lesa yii (LA-HTM) ko ni opin nipasẹ sisanra ti ibora tabi nipa iseda ti ibi-afẹde (afẹfẹ tabi immersion epo). Eyi ngbanilaaye eyikeyi lẹnsi ipinnu giga lori ọja lati ṣee lo. O tun ko jiya lati alapapo o lọra nitori inertia gbona (ṣe aṣeyọri alapapo lẹsẹkẹsẹ lori iwọn millisecond) ati pe o nlo awọn paati ti o wa ni iṣowo nikan. Awọn ifiyesi ailewu tuntun nikan ni ibatan si wiwa awọn ina ina lesa ti o lagbara (ni deede to 100 mW) inu ẹrọ ati o ṣee ṣe nipasẹ awọn oju, eyiti o nilo awọn goggles aabo.
Ilana ti LA-HTM ni lati lo ina lesa lati gbona ayẹwo ni agbegbe laarin aaye wiwo ti microscope (Fig. 1a). Lati ṣe eyi, awọn ayẹwo gbọdọ jẹ ina-gbigba. Lati lo agbara ina lesa ti o ni oye (kere ju 100 mW), a ko gbẹkẹle gbigba ti ina nipasẹ alabọde omi, ṣugbọn lainidi pọ si gbigba ti ayẹwo nipasẹ fifin sobusitireti pẹlu awọn ẹwẹ titobi goolu (Fig. 1c). Alapapo awọn ẹwẹ titobi goolu pẹlu ina jẹ pataki pataki si aaye ti awọn plasmonics gbona, pẹlu awọn ohun elo ti a nireti ni biomedicine, nanochemistry tabi ikore oorun29,30,31. Ni awọn ọdun diẹ sẹhin, a ti lo LA-HTM yii ni awọn iwadii pupọ ti o ni ibatan si awọn ohun elo pilasima gbona ni fisiksi, kemistri ati isedale. Iṣoro akọkọ pẹlu ọna yii wa ni iṣafihan profaili iwọn otutu ti o kẹhin, nitori iwọn otutu ti o ga ni opin si agbegbe microscale laarin apẹẹrẹ. A ti fihan pe maapu iwọn otutu le ṣe aṣeyọri pẹlu interferometer transverse irẹwẹsi gigun gigun mẹrin, ọna ti o rọrun, ipinnu giga-giga, ati ọna ifura pupọ ti maikirosikopu alakoso titobi ti o da lori lilo awọn gratings diffraction onisẹpo meji (ti a tun mọ si awọn gratings agbelebu) 33,34,35,36. Igbẹkẹle ti ilana ẹrọ airi gboona, ti o da lori microscopy grating wavefront microscopy (CGM), ti ṣe afihan ni awọn iwe mejila mejila ti a tẹjade ni ọdun mẹwa sẹhin37,38,39,40,41,42,43.
Ero ti fifi sori ẹrọ ti alapapo ina lesa ti o jọra, apẹrẹ ati maikirosikopu otutu. b Ayẹwo geometry ti o ni iyẹwu AttofluorTM kan ti o ni ibori ti a bo pẹlu awọn ẹwẹ titobi goolu. c Wo ni pẹkipẹki ni ayẹwo (kii ṣe iwọn). d n ṣe aṣoju profaili tan ina lesa aṣọ ati (e) pinpin iwọn otutu ti o tẹle lori ọkọ ofurufu ayẹwo ti awọn ẹwẹ titobi goolu. f jẹ profaili tan ina lesa annular ti o dara fun ṣiṣẹda iwọn otutu aṣọ kan bi o ṣe han ninu kikopa ti pinpin iwọn otutu ti abajade ti o han ni (g). Pẹpẹ iwọn: 30 µm.
Ni pataki, laipẹ a ṣaṣeyọri alapapo ti awọn sẹẹli mammalian pẹlu LA-HTM ati CGM ati tọpinpin awọn idahun mọnamọna ooru cellular ni iwọn 37-42°C, n ṣe afihan iwulo ilana yii si aworan sẹẹli alaaye kan. Sibẹsibẹ, ohun elo ti LA-HTM si iwadi ti awọn microorganisms ni awọn iwọn otutu giga kii ṣe aibikita, bi o ṣe nilo iṣọra diẹ sii ni akawe si awọn sẹẹli mammalian: ni akọkọ, alapapo isalẹ ti alabọde nipasẹ awọn mewa ti awọn iwọn (dipo awọn iwọn diẹ) awọn itọsọna si kan to lagbara inaro otutu ite. le ṣẹda ito convection 44 eyi ti, ti ko ba ìdúróṣinṣin so si awọn sobusitireti, le fa undesirable ronu ati dapọ ti kokoro arun. Yi convection le ti wa ni imukuro nipa atehinwa sisanra ti awọn omi Layer. Fun idi eyi, ni gbogbo awọn idanwo ti a gbekalẹ ni isalẹ, awọn idaduro kokoro-arun ni a gbe laarin awọn ideri meji to sunmọ 15 µm nipọn ti a gbe sinu ago irin kan (AttofluorTM, Thermofisher, Fig. 1b,c). Ni opo, convection le yago fun ti sisanra ti omi ba kere ju iwọn tan ina lesa alapapo. Ẹlẹẹkeji, ṣiṣẹ ni iru kan lopin geometry le suffocate aerobic oganisimu (wo Ọpọtọ. S2). A le yago fun iṣoro yii nipa lilo sobusitireti ti o le gba si atẹgun (tabi eyikeyi gaasi pataki miiran), nipa fifi awọn ifunfẹ afẹfẹ ti o ni idẹkùn sinu ibora, tabi nipa liluho awọn ihò ni ibori oke (wo Fig. S1) 45 . Ninu iwadi yii, a yan ojutu ti o kẹhin (Awọn nọmba 1b ati S1). Nikẹhin, alapapo laser ko pese pinpin iwọn otutu aṣọ. Paapaa ni kikankikan kanna ti ina ina lesa (Fig. 1d), pinpin iwọn otutu ko jẹ aṣọ, ṣugbọn dipo ti o jọmọ pinpin Gaussian nitori itọka igbona (Fig. 1e). Nigbati ibi-afẹde ni lati fi idi awọn iwọn otutu kongẹ ni aaye ti wiwo fun kikọ awọn ọna ṣiṣe ti ibi, awọn profaili uneven ko dara ati pe o tun le ja si gbigbe thermophoretic ti awọn kokoro arun ti wọn ko ba faramọ sobusitireti (wo aworan S3, S4)39. Ni ipari yii, a lo modulator imole aye (SLM) lati ṣe apẹrẹ ina infurarẹẹdi infurarẹẹdi ni ibamu si apẹrẹ oruka (Fig. 1f) ninu ọkọ ofurufu ti apẹẹrẹ lati ṣaṣeyọri pinpin iwọn otutu ti o ni ibamu daradara laarin agbegbe geometric ti a fun, pelu itọka igbona (Fig. 1d) 39, 42, 46. Gbe ideri oke kan sori satelaiti irin kan (Figure 1b) lati yago fun evaporation ti alabọde ati ki o ṣe akiyesi fun o kere ju awọn ọjọ diẹ. Nitoripe ideri oke yii ko ni edidi, afikun alabọde le ni irọrun ṣafikun nigbakugba ti o ba jẹ dandan.
Lati ṣapejuwe bii LA-HTM ṣe n ṣiṣẹ ati ṣafihan iwulo rẹ ninu iwadii thermophilic, a ṣe iwadi awọn kokoro arun aerobic Geobacillus stearothermophilus, eyiti o ni iwọn otutu idagbasoke to dara julọ ti ayika 60-65°C. Bakteria naa tun ni flagella ati agbara lati we, pese itọkasi miiran ti iṣẹ ṣiṣe cellular deede.
Awọn ayẹwo (Fig. 1b) ti wa ni iṣaju ni 60 ° C fun wakati kan ati lẹhinna gbe sinu idaduro ayẹwo LA-HTM. Ibẹrẹ iṣaju yii jẹ iyan, ṣugbọn tun wulo, fun awọn idi meji: Ni akọkọ, nigbati laser ba wa ni titan, o fa ki awọn sẹẹli dagba lẹsẹkẹsẹ ki o pin pin (wo fiimu M1 ni Awọn ohun elo Afikun). Laisi iṣaju iṣaju, idagbasoke kokoro-arun ni igbagbogbo ni idaduro nipasẹ awọn iṣẹju 40 ni gbogbo igba ti agbegbe wiwo tuntun ba gbona lori apẹẹrẹ. Keji, iṣaju iṣaju wakati 1 ṣe igbega ifaramọ ti awọn kokoro arun si ibori, idilọwọ awọn sẹẹli lati yiyọ kuro ni aaye wiwo nitori thermophoresis nigbati ina lesa ti wa ni titan (wo fiimu M2 ni Awọn ohun elo Afikun). Thermophoresis jẹ iṣipopada ti awọn patikulu tabi awọn ohun alumọni lẹgbẹẹ iwọn otutu, nigbagbogbo lati gbigbona si otutu, ati awọn kokoro arun kii ṣe iyasọtọ43,47. Ipa aifẹ yii jẹ imukuro lori agbegbe ti a fun nipasẹ lilo SLM lati ṣe apẹrẹ tan ina lesa ati ṣaṣeyọri pinpin iwọn otutu alapin.
Lori ọpọtọ. Nọmba 2 ṣe afihan pinpin iwọn otutu ti a ṣe iwọn nipasẹ CGM ti o gba nipasẹ itanna sobusitireti gilasi ti a bo pẹlu awọn ẹwẹ titobi goolu pẹlu tan ina lesa annular (Fig. 1f). Pipin iwọn otutu alapin ni a ṣe akiyesi lori gbogbo agbegbe ti a bo nipasẹ tan ina lesa. A ṣeto agbegbe yii si 65°C, iwọn otutu idagbasoke to dara julọ. Ni ita agbegbe yii, iṣipopada iwọn otutu nipa ti ara ṣubu si \(1/r\) (nibiti \(r\) jẹ ipoidojuko radial).
maapu iwọn otutu ti awọn wiwọn CGM ti a gba nipasẹ lilo ina ina lesa annular lati tan itanna kan Layer ti awọn ẹwẹ titobi goolu lati gba profaili iwọn otutu alapin lori agbegbe ipin kan. b Isotherm ti maapu otutu (a). Egbegbe ti ina ina lesa ni ipoduduro nipasẹ aaye ti aami grẹy kan. Atunwo idanwo naa ni ẹẹmeji (wo Awọn ohun elo Iyọnda, olusin S4).
A ṣe abojuto ṣiṣeeṣe ti awọn sẹẹli kokoro arun fun awọn wakati pupọ nipa lilo LA-HTM. Lori ọpọtọ. 3 ṣe afihan aarin akoko fun awọn aworan mẹrin ti o ya lati fiimu iṣẹju 3 wakati 20 (Movie M3, Alaye Afikun). A ṣe akiyesi awọn kokoro arun lati tan kaakiri laarin agbegbe ipin ti asọye nipasẹ lesa nibiti iwọn otutu ti dara julọ, ti o sunmọ 65°C. Ni idakeji, idagba sẹẹli ti dinku ni pataki nigbati iwọn otutu ṣubu ni isalẹ 50 ° C fun awọn iṣẹju 10.
Awọn aworan ijinle opitika ti G. stearothermophilus kokoro arun ti o dagba lẹhin alapapo laser ni awọn akoko oriṣiriṣi, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, kuro ninu 200 Ti yọ jade lati fiimu iṣẹju kan (fiimu M3 ti a pese ni Alaye Afikun) ti o wa lori maapu iwọn otutu ti o baamu. Awọn lesa wa ni titan ni akoko \(t=0\). Isotherms ti ni afikun si aworan kikankikan.
Lati ṣe iwọn idagba sẹẹli ati igbẹkẹle rẹ si iwọn otutu, a ṣe iwọn ilosoke ninu baomasi ti awọn ileto orisirisi ti awọn kokoro arun ti o ya sọtọ ni ibẹrẹ fiimu M3 aaye wiwo (Fig. 4). Awọn kokoro arun obi ti a ti yan ni ibẹrẹ ti mini ileto lara kuro (mCFU) Ibiyi han ni Figure S6. Awọn wiwọn ibi-gbigbẹ ni a mu pẹlu kamẹra CGM 48 eyiti a lo lati ṣe maapu pinpin iwọn otutu. Agbara CGM lati wiwọn iwuwo gbigbẹ ati iwọn otutu jẹ agbara ti LA-HTM. Gẹgẹbi a ti ṣe yẹ, iwọn otutu ti o ga julọ fa idagbasoke kokoro-arun yiyara (Fig. 4a). Gẹgẹbi o ṣe han ninu aaye ologbele-log ni Ọpọtọ 4b, idagba ni gbogbo awọn iwọn otutu tẹle idagbasoke ti o pọju, nibiti data naa ti nlo iṣẹ apinfunni \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau}+ {{ \mbox{cst}}}\), nibiti \(\tau {{{{\rm{log }}}}}}2\) – akoko iran (tabi akoko ilọpo meji), \( g =1/ \ tau \) – oṣuwọn idagba (nọmba awọn ipin fun akoko ẹyọkan). Lori ọpọtọ. 4c ṣe afihan oṣuwọn idagbasoke oniwun ati akoko iran bi iṣẹ ti iwọn otutu. Awọn mCFU ti o dagba ni iyara jẹ ifihan nipasẹ itẹlọrun ti idagba lẹhin awọn wakati meji, ihuwasi ti a nireti nitori iwuwo kokoro-arun giga (bii ipele iduro ni awọn aṣa olomi kilasika). Apẹrẹ gbogbogbo \ (g \ osi (T \ ọtun) \) (Fig. 4c) ni ibamu si ọna ti o ti ṣe yẹ ti ipele meji fun G. stearothermophilus pẹlu iwọn idagba to dara julọ ni ayika 60-65 ° C. Baramu data naa ni lilo awoṣe Cardinal kan (Figure S5)49 nibiti \(\osi ({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt}}) ; {T}_{{\max}} \ ọtun) \) = (0.70 ± 0.2; 40 ± 4; 65 ± 1.6; 67 ± 3) °C, eyiti o ni ibamu daradara pẹlu awọn iye miiran ti a tọka si ninu awọn litireso49. Botilẹjẹpe awọn paramita ti o gbẹkẹle iwọn otutu jẹ atunṣe, iwọn idagbasoke ti o pọju ti \({G}_{0}\) le yatọ lati idanwo kan si omiran (wo awọn isiro S7-S9 ati fiimu M4). Ni idakeji si awọn ipele ti o yẹ ni iwọn otutu, eyiti o yẹ ki o jẹ gbogbo agbaye, iwọn idagbasoke ti o pọju da lori awọn ohun-ini ti alabọde (wiwa awọn eroja, ifọkansi atẹgun) laarin geometry microscale ti a ṣe akiyesi.
a makirobia idagbasoke ni orisirisi awọn iwọn otutu. mCFU: Kekere Colony Lara Units. Awọn data ti a gba lati fidio ti kokoro arun kan ti o dagba ni iwọn otutu (fiimu M3). b Kanna bi (a), ologbele-logarithmic asekale. c Iwọn idagbasoke \ (\ tau \) ati akoko iran \ (g \) ti a ṣe iṣiro lati ipadasẹhin laini (b). Awọn ifi aṣiṣe petele: iwọn otutu lori eyiti awọn mCFU ti fẹ si aaye wiwo lakoko idagbasoke. Awọn ifipa aṣiṣe inaro: aṣiṣe odiwọn ipadasẹhin laini.
Ni afikun si idagba deede, diẹ ninu awọn kokoro arun nigbakan ṣan sinu wiwo lakoko alapapo laser, eyiti o jẹ ihuwasi ti a nireti fun awọn kokoro arun pẹlu flagella. Fiimu M5 ni afikun alaye fihan iru awọn iṣẹ iwẹ. Ninu adanwo yii, itanna lesa aṣọ ni a lo lati ṣẹda iwọn otutu, bi o ṣe han ninu Awọn eeya 1d, e ati S3. Nọmba 5 ṣe afihan awọn ilana aworan meji ti a yan lati fiimu M5 ti n fihan pe kokoro-arun kan ṣe afihan iṣipopada itọsọna lakoko ti gbogbo awọn kokoro arun miiran wa laisi iṣipopada.
Awọn fireemu akoko meji (a) ati (b) ṣe afihan odo ti awọn kokoro arun oriṣiriṣi meji ti o samisi pẹlu awọn iyika aami. Awọn aworan ni a fa jade lati fiimu M5 (ti a pese bi ohun elo afikun).
Ninu ọran ti G. stearothermophilus, iṣipopada ti nṣiṣe lọwọ ti awọn kokoro arun (Fig. 5) bẹrẹ ni iṣẹju diẹ lẹhin ti tan ina lesa ti wa ni titan. Akiyesi yii n tẹnuba idahun igba diẹ ti microorganism thermophilic si ilosoke ninu iwọn otutu, bi a ti ṣe akiyesi tẹlẹ nipasẹ Mora et al. 24 . Koko-ọrọ ti motility kokoro-arun ati paapaa thermotaxis le ṣe iwadii siwaju sii nipa lilo LA-HTM.
Wiwẹ microbial ko yẹ ki o ni idamu pẹlu awọn iru iṣipopada ti ara miiran, eyun (i) išipopada Brownian, eyiti o dabi pe o jẹ iṣipopada rudurudu ti ko si itọsọna pato, (ii) convection 50 ati thermophoresis 43, ti o wa ninu iṣipopada deede ti iṣipopada pẹlu iwọn otutu kan. itesiwaju.
G. stearothermophilus ni a mọ fun agbara rẹ lati ṣe agbejade awọn spores ti o lagbara pupọ (Idasilẹ spore) nigbati o farahan si awọn ipo ayika ti ko dara bi aabo. Nigbati awọn ipo ayika ba tun dara lẹẹkansi, awọn spores yoo dagba, ti o ṣẹda awọn sẹẹli alãye ati tun bẹrẹ idagbasoke. Botilẹjẹpe ilana sporulation / germination yii jẹ olokiki daradara, ko ti ṣe akiyesi ni akoko gidi. Lilo LA-HTM, a ṣe ijabọ nibi akiyesi akọkọ ti awọn iṣẹlẹ germination ni G. stearothermophilus.
Lori ọpọtọ. 6a fihan awọn aworan ti o ti kọja akoko ti ijinle opitika (OT) ti a gba ni lilo eto CGM ti awọn ere 13. Fun gbogbo akoko ikojọpọ (15 h 6 min, \ (t = 0 \) - ibẹrẹ ti alapapo ina lesa), 4 ninu 13 spores ti dagba, ni awọn aaye akoko itẹlera \ (t=2 \) h, \ ( 3 \) ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' àti \(11\) h \(30\)'. Botilẹjẹpe ọkan ninu awọn iṣẹlẹ wọnyi ni o han ni Nọmba 6, awọn iṣẹlẹ germination 4 ni a le ṣe akiyesi ni fiimu M6 ninu ohun elo afikun. O yanilenu, germination han lati wa ni aileto: kii ṣe gbogbo awọn spores ti ndagba ati ki o ko dagba ni akoko kanna, pelu awọn iyipada kanna ni awọn ipo ayika.
Aago-lapse ti o ni awọn aworan 8 OT (immersion epo, 60x, 1.25 NA ohun to) ati (b) itankalẹ baomasi ti awọn akopọ G. stearothermophilus. c (b) Ti a ya lori iwọn ologbele-log lati ṣe afihan laini ti oṣuwọn idagba (laini ti a fi silẹ).
Lori ọpọtọ. 6b,c ṣe afihan biomass ti awọn olugbe sẹẹli ni aaye wiwo gẹgẹbi iṣẹ akoko lori gbogbo akoko gbigba data. Iyara ibajẹ ti ibi-gbigbẹ ti a ṣe akiyesi ni \(t=5 \) h ni ọpọtọ. 6b, c, nitori ijade diẹ ninu awọn sẹẹli lati aaye wiwo. Iwọn idagba ti awọn iṣẹlẹ mẹrin wọnyi jẹ \ (0.77\pm 0.1 \) h-1. Iwọn yii ga ju iwọn idagba ti o ni nkan ṣe pẹlu Nọmba 3. 3 ati 4, nibiti awọn sẹẹli dagba ni deede. Idi fun ilosoke idagbasoke ti G. stearothermophilus lati awọn spores jẹ koyewa, ṣugbọn awọn wiwọn wọnyi ṣe afihan anfani ti LA-HTM ati ṣiṣẹ ni ipele sẹẹli kan (tabi ni ipele mCFU nikan) lati ni imọ siwaju sii nipa awọn iyipada ti igbesi aye sẹẹli. .
Lati ṣe afihan siwaju sii iyipada ti LA-HTM ati iṣẹ rẹ ni awọn iwọn otutu giga, a ṣe ayẹwo idagba Sulfolobus shibatae, hyperthermophilic acidophilic archaea pẹlu iwọn otutu idagbasoke to dara julọ ti 80 ° C51. Ti a ṣe afiwe si G. stearothermophilus, archaea wọnyi tun ni ẹda ti o yatọ pupọ, ti o dabi 1 micron spheres (cocci) dipo awọn ọpa elongated (bacilli).
Olusin 7a ni awọn aworan ijinle opiti lesese ti S. shibatae mCFU ti a gba ni lilo CGM (wo fiimu ẹya M7 ni Awọn ohun elo Iyọkuro). MCFU yii n dagba ni ayika 73°C, ni isalẹ iwọn otutu to dara julọ ti 80°C, ṣugbọn laarin iwọn otutu fun idagba lọwọ. A ṣe akiyesi awọn iṣẹlẹ fission pupọ ti o jẹ ki awọn mCFU dabi awọn micrograpes ti archaea lẹhin awọn wakati diẹ. Lati awọn aworan OT wọnyi, mCFU biomass ni a wọn lori akoko ati gbekalẹ ni Nọmba 7b. O yanilenu, S. shibatae mCFUs ṣe afihan idagbasoke laini dipo idagbasoke ti o pọju ti a rii pẹlu G. stearothermophilus mCFUs. Ifọrọwọrọ igba pipẹ ti wa 52 nipa iseda ti awọn oṣuwọn idagbasoke sẹẹli: lakoko ti awọn ẹkọ kan ṣe ijabọ awọn oṣuwọn idagbasoke ti awọn microbes ti o ni ibamu si iwọn wọn (idagbasoke ti o pọju), awọn miiran ṣe afihan oṣuwọn igbagbogbo (idagbasoke laini tabi bilinear). Gẹgẹbi a ti ṣalaye nipasẹ Tzur et al.53, iyatọ laarin iwọn ati (bi) idagba laini nilo deede ti <6% ni awọn wiwọn biomass, eyiti ko ni arọwọto fun ọpọlọpọ awọn ilana QPM, paapaa pẹlu interferometry. Gẹgẹbi a ti ṣalaye nipasẹ Tzur et al.53, iyatọ laarin iwọn ati (bi) idagba laini nilo deede ti <6% ni awọn wiwọn biomass, eyiti ko ni arọwọto fun ọpọlọpọ awọn ilana QPM, paapaa pẹlu interferometry. Как OBъяснили Цур и др.53, различение эksponentsialnogo и (bи) linseynogo rostta требует точноsty <6% остижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. Gẹgẹbi a ti ṣalaye nipasẹ Zur et al.53, iyatọ laarin iwọn ati (bi) idagba laini nilo <6% deede ni awọn wiwọn biomass, eyiti ko ṣee ṣe fun ọpọlọpọ awọn ọna QPM, paapaa lilo interferometry.Gẹgẹbi alaye nipasẹ Zur et al. 53, iyatọ laarin iwọn ati (bi) idagba laini nilo kere ju 6% deede ni awọn wiwọn baomasi, eyiti ko ṣee ṣe fun ọpọlọpọ awọn ọna QPM, paapaa nigba lilo interferometry. CGM ṣe aṣeyọri deede yii pẹlu išedede sub-pg ni awọn wiwọn baomasi36,48.
Aago-lapse ti o ni awọn aworan 6 OT (immersion epo, 60x, NA ohun to 1.25) ati (b) itankalẹ baomasi micro-CFU ti a wọn pẹlu CGM. Wo fiimu M7 fun alaye diẹ sii.
Idagba laini pipe ti S. shibatae jẹ airotẹlẹ ati pe ko tii royin. Bibẹẹkọ, idagba ti o pọju ni a nireti, o kere ju nitori ni akoko pupọ, awọn ipin pupọ ti 2, 4, 8, 16… awọn sẹẹli gbọdọ waye. A pinnu pe idagbasoke laini le jẹ nitori idinamọ sẹẹli nitori iṣakojọpọ sẹẹli iwuwo, gẹgẹ bi idagba sẹẹli ṣe fa fifalẹ ati nikẹhin de ipo isinmi nigbati iwuwo sẹẹli ba ga ju.
A pari nipa sisọ awọn aaye marun ti iwulo wọnyi ni titan: idinku ninu iwọn didun alapapo, idinku ninu inertia gbona, iwulo ninu awọn ẹwẹ titobi goolu, iwulo ni maikirosikopu alakoso titobi, ati iwọn otutu ti o ṣeeṣe ninu eyiti LA-HTM le ṣee lo.
Ti a ṣe afiwe si alapapo resistive, alapapo laser ti a lo fun idagbasoke HTM nfunni ni ọpọlọpọ awọn anfani, eyiti a ṣapejuwe ninu iwadi yii. Ni pataki, ni media olomi ni aaye wiwo ti maikirosikopu, iwọn didun alapapo ti wa ni ipamọ laarin awọn iwọn diẹ (10 μm) 3. Ni ọna yii, awọn microbes ti a ṣe akiyesi nikan ni o ṣiṣẹ, lakoko ti awọn kokoro arun miiran wa ni isinmi ati pe a le lo lati ṣe iwadi siwaju sii ayẹwo - ko si ye lati yi ayẹwo pada ni gbogbo igba ti iwọn otutu titun nilo lati ṣayẹwo. Ni afikun, alapapo microscale ngbanilaaye idanwo taara ti awọn iwọn otutu ti o tobi pupọ: Nọmba 4c ni a gba lati fiimu 3-wakati (Movie M3), eyiti o nigbagbogbo nilo igbaradi ati idanwo ti awọn apẹẹrẹ pupọ - ọkan fun ọkọọkan awọn ayẹwo ti o wa labẹ iwadi. y jẹ iwọn otutu ti o nsoju nọmba awọn ọjọ ninu idanwo naa. Idinku iwọn didun kikan tun tọju gbogbo awọn paati opiti agbegbe ti maikirosikopu, paapaa lẹnsi idi, ni iwọn otutu yara, eyiti o jẹ iṣoro pataki ti agbegbe ti dojukọ titi di isisiyi. LA-HTM le ṣee lo pẹlu eyikeyi lẹnsi, pẹlu awọn lẹnsi immersion epo, ati pe yoo duro ni iwọn otutu yara paapaa pẹlu awọn iwọn otutu to gaju ni aaye wiwo. Idiwọn akọkọ ti ọna alapapo lesa ti a jabo ninu iwadi yii ni pe awọn sẹẹli ti ko faramọ tabi leefofo le jina si aaye wiwo ati pe o nira lati ṣe iwadi. Iṣeduro iṣẹ le jẹ lati lo awọn lẹnsi titobi kekere lati ṣaṣeyọri iwọn otutu ti o tobi ju diẹ sii ju ọgọrun microns lọ. Išọra yii wa pẹlu idinku ninu ipinnu aaye, ṣugbọn ti ibi-afẹde ba ni lati kawe iṣipopada ti awọn microorganisms, ipinnu aaye giga ko nilo.
Iwọn akoko fun alapapo (ati itutu agbaiye) eto \({{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}} \) da lori iwọn rẹ, gege bi ofin \({{{({\rm{\tau }}}}}}_{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), nibiti \ (L \) jẹ iwọn abuda ti orisun ooru (iwọn ila opin ti ina ina lesa ninu iwadi wa jẹ \(L \ nipa 100 \) μm), \ (D \) jẹ itọsi igbona ti agbegbe (apapọ ninu wa irú, gilasi ati omi Oṣuwọn Itankale \(D \ nipa 2 \ agbo {10}^{-7} \) m2/s). Awọn ayipada iwọn otutu, le nireti idasile lẹsẹkẹsẹ ti iwọn otutu kii ṣe kikuru iye akoko idanwo naa, ṣugbọn tun gba akoko deede \(t=0 \) fun eyikeyi iwadii agbara ti awọn ipa iwọn otutu.
Ọna ti a dabaa wa wulo si eyikeyi sobusitireti gbigba ina (fun apẹẹrẹ, awọn ayẹwo iṣowo pẹlu ibora ITO). Sibẹsibẹ, awọn ẹwẹ titobi goolu ni anfani lati pese gbigba giga ni infurarẹẹdi ati iwọn kekere ni ibiti o ti han, awọn abuda ti o kẹhin ti o jẹ anfani fun akiyesi opiti ti o munadoko ni ibiti o han, paapaa nigba lilo fluorescence. Ni afikun, goolu jẹ ibaramu biocompatible, inert kemikali, iwuwo opiti le ṣe atunṣe lati 530 nm si isunmọ infurarẹẹdi, ati igbaradi apẹẹrẹ jẹ rọrun ati ọrọ-aje29.
Ikọja grating wavefront microscopy (CGM) ngbanilaaye kii ṣe maapu iwọn otutu nikan ni microscale, ṣugbọn tun ṣe abojuto baomasi, ti o jẹ ki o wulo paapaa (ti ko ba wulo) ni apapo pẹlu LA-HTM. Ni ọdun mẹwa to kọja, awọn ilana imọ-ẹrọ microscopy otutu miiran ti ni idagbasoke, paapaa ni aaye ti bioimaging, ati pupọ julọ wọn nilo lilo awọn iwadii fluorescent ti o ni iwọn otutu54,55. Sibẹsibẹ, awọn ọna wọnyi ni a ti ṣofintoto ati diẹ ninu awọn ijabọ ti wiwọn awọn iyipada iwọn otutu ti ko ni otitọ laarin awọn sẹẹli, o ṣee ṣe nitori otitọ pe fluorescence da lori ọpọlọpọ awọn ifosiwewe miiran ju iwọn otutu lọ. Ni afikun, ọpọlọpọ awọn iwadii fluorescent jẹ riru ni awọn iwọn otutu giga. Nitorinaa, QPM ati ni pataki CGM ṣe aṣoju ilana imọ-jinlẹ iwọn otutu ti o dara julọ fun kikọ ẹkọ igbesi aye ni awọn iwọn otutu giga nipa lilo airi opiti.
Awọn ẹkọ ti S. shibatae, eyiti o wa laaye ni aipe ni 80 ° C, fihan pe LA-HTM le ṣee lo lati ṣe iwadi awọn hyperthermophiles, kii ṣe awọn thermophiles ti o rọrun nikan. Ni opo, ko si opin si iwọn awọn iwọn otutu ti o le de ọdọ lilo LA-HTM, ati paapaa awọn iwọn otutu ti o ga ju 100 ° C le de ọdọ ni titẹ oju aye laisi farabale, bi a ti ṣe afihan nipasẹ ẹgbẹ wa ti 38 ni awọn ohun elo kemistri hydrothermal ni oju aye. titẹ A. A lo laser fun alapapo awọn ẹwẹ titobi goolu 40 ni ọna kanna. Nitorinaa, LA-HTM ni agbara lati ṣee lo lati ṣe akiyesi awọn hyperthermophiles ti a ko tii ri tẹlẹ pẹlu microscopy opitika iwọn giga ti o ga labẹ awọn ipo boṣewa (ie labẹ aapọn ayika).
Gbogbo awọn idanwo ni a ṣe ni lilo maikirosikopu ti ile, pẹlu itanna Köhler (pẹlu LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), dimu apẹrẹ pẹlu gbigbe xy afọwọṣe, awọn ibi-afẹde (Olympus, 60x, 0.7 NA, air, LUCPlanFLN60X tabi 60x, Oil 1.25 NA , UPLFLN60XOI), kamẹra CGM (QLSI agbelebu grating, 39 µm ipolowo, 0.87 mm lati Andor Zyla sensọ kamẹra) lati pese kikankikan ati aworan igbi iwaju, ati kamẹra sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, ipo 16-bit, lati Hamamatsu) lati ṣe igbasilẹ naa data han ni Figure 5 (bakteria odo). Dichroic tan ina splitter jẹ 749 nm BrightLine eti (Semrock, FF749-SDi01). Àlẹmọ ni iwaju kamẹra jẹ àlẹmọ kukuru kukuru 694 (FF02-694/SP-25, Semrock). Titanium sapphire laser (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, fa fifalẹ iho laser tsunami, Spectra-Physics in Fig. 2-5, siwaju sii rọpo nipasẹ Millenia laser, Spectraphysics 10 W, fifa Mira laser cavity, Coherent, fun 2 Fig. -5). 6 ati 7) ni a ṣeto si igbi igbi \({{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, eyi ti o ni ibamu si plasmon resonance spectrum ti awọn ẹwẹ titobi wura. Awọn modulators Spatial light (1920 × Awọn piksẹli 1152) ni a ti ra lati Meadowlark Optics.
Cross grating wavefront maikirosikopu (CGM) jẹ ilana maikirosikopu opiti ti o da lori pipọpọ grating diffraction onisẹpo meji (ti a tun mọ ni grating agbelebu) ni ijinna ti milimita kan lati sensọ kamẹra aṣa. Apeere ti o wọpọ julọ ti CGM ti a ti lo ninu iwadi yii ni a pe ni interferometer transverse transverse iṣipota mẹrin-wefulenti (QLSI), nibiti agbelebu-grating jẹ ti kikankikan / ilana checkerboard ilana ti a ṣe ati itọsi nipasẹ Primot et al. ni 200034. Awọn inaro ati petele grating ila ṣẹda akoj-bi Shadows lori sensọ, iparun ti eyi ti o le wa ni numerically ni ilọsiwaju ni akoko gidi lati gba awọn opitika wavefront iparun (tabi deede alakoso profaili) ti isẹlẹ ina. Nigbati a ba lo lori maikirosikopu kan, kamẹra CGM le ṣe afihan iyatọ ipa ọna opitika ti ohun ti o ni aworan, ti a tun mọ ni ijinle opitika (OT), pẹlu ifamọ lori aṣẹ ti nanometers36. Ni wiwọn CGM eyikeyi, lati le yọkuro awọn abawọn eyikeyi ninu awọn paati opiti tabi awọn opo, aworan itọkasi OT akọkọ gbọdọ ya ati yọkuro lati eyikeyi awọn aworan ti o tẹle.
Maikirosikopu iwọn otutu ni a ṣe nipa lilo kamẹra CGM bi a ti ṣalaye ninu itọkasi. 32. Ni kukuru, alapapo omi kan yipada itọka itọka rẹ, ṣiṣẹda ipa lẹnsi igbona ti o da tan ina isẹlẹ naa jẹ. Iyatọ oju igbi yii jẹ iwọn nipasẹ CGM ati ṣiṣe ni lilo algorithm deconvolution lati gba pinpin iwọn otutu onisẹpo mẹta ni alabọde olomi. Ti a ba pin awọn ẹwẹ titobi goolu ni deede jakejado apẹẹrẹ, maapu iwọn otutu le ṣee ṣe ni awọn agbegbe ti ko ni kokoro arun lati ṣe awọn aworan ti o dara julọ, eyiti o jẹ ohun ti a ṣe nigba miiran. Itọkasi aworan CGM ni a gba laisi alapapo (pẹlu ina lesa) ati lẹhinna mu ni ipo kanna ni aworan pẹlu ina lesa.
Iwọn ibi-gbigbẹ ti waye ni lilo kamẹra CGM kanna ti a lo fun aworan iwọn otutu. Awọn aworan itọkasi CGM ni a gba nipasẹ gbigbe ayẹwo ni iyara ni x ati y lakoko ifihan bi ọna ti aropin eyikeyi inhomogeneity ni OT nitori wiwa awọn kokoro arun. Lati awọn aworan OT ti kokoro arun, a ti gba biomass wọn ni lilo akojọpọ awọn aworan lori awọn agbegbe ti a yan nipa lilo algorithm ipin ibilẹ ti Matlab (wo apakan “koodu nọmba”), ni atẹle ilana ti a ṣalaye ninu Ref. 48. Ní kúkúrú, à ńlò ìbátan \(m={\alpha}^{-1}\int {{\mbox{OT}}\òsì(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), nibiti \({{\mbox{OT}}}\osi(x,y\right)\) je aworan ijinle opitika, \(m\) wa iwuwo gbigbẹ ati \({{{{\rm{\alpha }}}}}\) jẹ igbagbogbo. A yan \({{{\rm{\alpha))))))=0.18\) µm3/pg, tí ó jẹ́ àpèjúwe fún àwọn sẹ́ẹ̀lì alààyè.
Ideri ideri 25 mm ni iwọn ila opin ati 150 µm nipọn ti a bo pẹlu awọn ẹwẹ titobi goolu ni a gbe sinu iyẹwu AttofluorTM kan (Thermofisher) pẹlu awọn ẹwẹ titobi goolu ti nkọju si oke. Geobacillus stearothermophilus jẹ precultured moju ni LB alabọde (200 rpm, 60°C) ṣaaju ọjọ kọọkan ti awọn adanwo. Idaduro 5 µl kan ti G. stearothermophilus pẹlu iwuwo opitika (OD) ti 0.3 si 0.5 ni a gbe sori isokuso ideri pẹlu awọn ẹwẹ titobi goolu. Lẹhinna, isokuso ideri yika 18 mm ni iwọn ila opin pẹlu iho 5 mm ni iwọn ila opin ni aarin ti lọ silẹ si ju silẹ, ati 5 μl ti idaduro kokoro-arun pẹlu iwuwo opitika kanna ni a lo leralera si aarin iho naa. Awọn kanga ti o wa lori awọn ideri ni a pese sile ni ibamu pẹlu ilana ti a ṣalaye ninu ref. 45 (wo Alaye Afikun fun alaye diẹ sii). Lẹhinna ṣafikun milimita 1 ti alabọde LB si ibora lati yago fun ipele omi lati gbigbe jade. Ibori ti o kẹhin ni a gbe sori ideri pipade ti iyẹwu Attofluor™ lati ṣe idiwọ evaporation ti alabọde lakoko isubu. Fun awọn adanwo germination, a lo awọn spores, eyiti, lẹhin awọn adanwo ti aṣa, nigbakan bo ibori oke. Ọna ti o jọra ni a lo lati gba Sulfolobus shibatae. Ọjọ mẹta (200 rpm, 75 ° C) ti ogbin alakoko ti Thiobacillus serrata ni a ṣe ni alabọde 182 (DSMZ).
Awọn apẹẹrẹ ti awọn ẹwẹ titobi goolu ni a pese sile nipasẹ micellar block copolymer lithography. Ilana yii jẹ apejuwe ni apejuwe ni Chap. 60. Ni ṣoki, awọn micelles ti o ni awọn ions goolu ni a ṣepọ nipasẹ didapọ copolymer pẹlu HAuCl4 ni toluene. Awọn ideri ti a ti sọ di mimọ lẹhinna fi omi ṣan sinu ojutu ati tọju pẹlu itanna UV ni iwaju oluranlowo idinku lati gba awọn irugbin goolu. Nikẹhin, awọn irugbin goolu ni a dagba nipasẹ kikan si ibori pẹlu ojutu olomi ti KAuCl4 ati ethanolamine fun awọn iṣẹju 16, eyiti o yorisi ni akoko-akoko ati iṣeto aṣọ pupọ ti awọn ẹwẹ titobi goolu ti kii ṣe iyipo ni infurarẹẹdi ti o sunmọ.
Lati yi awọn interferogram pada si awọn aworan OT, a lo algorithm ti ile, gẹgẹbi alaye ninu ọna asopọ. 33 ati pe o wa bi package Matlab kan ni ibi ipamọ gbogbo eniyan atẹle: https://github.com/baffou/CGMprocess. Apo naa le ṣe iṣiro kikankikan ati awọn aworan OT ti o da lori awọn interferograms ti o gbasilẹ (pẹlu awọn aworan itọkasi) ati awọn ijinna titobi kamẹra.
Lati ṣe iṣiro apẹẹrẹ alakoso ti a lo si SLM lati gba profaili iwọn otutu ti a fun, a lo algorithm39,42 ti ile ti a ṣe tẹlẹ ti o wa ni ibi ipamọ gbogbo eniyan atẹle: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Iṣawọle jẹ aaye iwọn otutu ti o fẹ, eyiti o le ṣeto ni oni-nọmba tabi nipasẹ aworan bmp monochrome kan.
Lati pin awọn sẹẹli ati wiwọn iwuwo gbigbẹ wọn, a lo algorithm Matlab wa ti a tẹjade ni ibi ipamọ gbogbo eniyan atẹle: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Lori aworan kọọkan, olumulo gbọdọ tẹ lori kokoro arun tabi mCFU ti iwulo, ṣatunṣe ifamọ wand, ati jẹrisi yiyan.
Fun alaye diẹ sii lori apẹrẹ ikẹkọ, wo Afoyemọ Ijabọ Iwadi Iseda ti o sopọ mọ nkan yii.
Data ti n ṣe atilẹyin awọn abajade iwadi yii wa lati ọdọ awọn onkọwe oniwun lori ibeere ti o tọ.
Awọn koodu orisun ti a lo ninu iwadi yii jẹ alaye ni apakan Awọn ọna, ati awọn ẹya yokokoro le ṣe igbasilẹ lati https://github.com/baffou/ ninu awọn ibi ipamọ wọnyi: SLM_temperatureShaping, CGMprocess, ati CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight sinu thermophiles ati awọn ohun elo titobi wọn. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight sinu thermophiles ati awọn ohun elo titobi wọn.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. ati Sharma, AK Akopọ ti thermophiles ati ohun elo wọn jakejado. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. ati Sharma AK Imọye ti o jinlẹ ti awọn thermophiles ati ọpọlọpọ awọn ohun elo.3 Biotechnology 6, 81 (2016).
Akoko ifiweranṣẹ: Oṣu Kẹsan-26-2022